Мезенхимальные стволовые клетки в ветеринарной хирургии, способ их выделения и характеристика жизнеспособности

December 25, 2017

   Теория возобновления тканей за счет самоподдерживаемого количества стволовых клеток была впервые сформулирована более 100 лет назад при изучении кроветворения 

В настоящее время мезенхимальные стволовые клетки (МСК) выделены из многих тканей взрослого человека, таких как: висцеральная и подкожная жировая ткань (ЖТ), костный мозг, пульпа зуба, периодонтальная связка, легкие, хрящ, сухожилия, ткань скелетных мышц, пуповинная кровь и др. Но необходимо учитывать, что МСК, полученные из различных тканей, даже при культивировании в одних и тех же условиях отличаются друг от друга по способности формировать колонии, экспрессии генов и дифференцировочному потенциалу.

    В течение длительного времени использование стволовых клеток (СК) в клинической практике ограничивалось сложностью и травматичностью получения вышеперечисленных биологических материалов, что могло вести к рискам и осложнениям. В 2001 году группе ученых под руководством P.A. Zuk удалось культивировать и изучить МСК, полученные из аутологичной жировой ткани человека.

Клеточные технологии - новое направление исследований, которое объединяет физиологические, генетические и клинические подходы.

В настоящее время нет единозначного мнения исследователей об оптимальном способе экстракции ЖТ из донорского участка тела человека или животного для получения из нее СК[9]. В связи с этим перед нами была поставлена задача разработать способ забора ЖТ собак для выделения СК.

    Исследования проводили  в «Городском ветеринарном лечебно-диагностическом центре №1» и в лаборатории Института высокомолекулярных соединений РАН.

Для исследований использовали подкожную ЖТ сук, взятую у 3 клинически здоровых животных в возрасте от 2-х до 6-ти лет, во время проведения ОГЭ. В первом случае животное было в возрасте 2года 3 месяца, живой массой 21.5 кг, содержалось в условиях ветеринарной клиники на передержке в течение 2-х месяцев. Второе и третье животные содержались в домашних условиях. Возрастом и весом соответственно: 3года 8 месяцев, массой 10.7 кг и 6 лет 2 месяца, массой тела 36 кг.

При отборе животных для опыта особое внимание обращали на то, что бы животные-доноры были клинически здоровы и вакцинированы, не страдали бы хроническими и  онкологическими заболеваниями, не имели бы среднюю и высокую степень ожирения.

В настоящее время используют несколько модифицированных технологий выделения СК из ЖТ, но большинство из них мало отличаются от базисного метода, который основывается на мануальном режиме с применением ферментов. В нашей работе мы усовершенствовали и применили один из таких мануальных методов с применением коллагеназы I-го типа, с учетом необходимых требований и условий.

    Во время проведения плановой ОГЭ в области места разреза по белой линии живота брался небольшой фрагмент (примерно 1-1.5 см3) подкожной ЖТ, который отмывался от крови в фосфатно-буферном растворе Дульбекко (DPBS-Dulbeccoʼs phosphate buffered saline).С использованием лабораторных весов серии CJ производства Shinko Denshi отбирали фрагмент ЖТ массой 2 гр., затем его помещали в специальный контейнер (рис. 1) с раствором, который использовали для отмывания. Далее образец доставляли в лабораторию. Материал должен храниться при комнатной температуре и обрабатываться в течение первых суток после экстракции его из животного, поскольку длительное хранение изымаемого субстрата ведет к снижению выживаемости СК.

Для предотвращения контаминации бактериями клеточной культуры все работы по выделению СК из ЖТ проводят в ламинарном боксе. Обычно используют боксы II класса защиты, которые защищают не только биологический материал, но и оператора по работе с ним.

    Первоначально образцы ЖТ промывали раствором Хэнкса (HBSS-Hankʼs balanced salt solution) с добавлением антибактериальных и антимикотических препаратов (1% раствора пенициллина и 1% раствора амфотерицина В) для снижения микробной контаминации материала и исключения неклеточного загрязнения сформированного биологического материала [4]. После промывки ткань гомогенезировали стерильными ножницами в течение 10 минут. После промывания гомогенезированной ЖТ приступали к этапу ферментизации раствором коллагеназы с целью освобождения компонентов стромально-васкулярной фракции (СВФ), которая содержит СК [3]. Ферментизацию проводили в шейкере-инкубаторе (рис. 3)в течение1-2 часов с учетом  мнения других исследователей.

Следующим этапом в выделении СК из ЖТ являлось ступенчатое центрифугирование, в ходе которого в верхнем слое супернатанта (надосадочной жидкости) концентрируются масло и адипоциты, в среднем слое осаждаются коллагеназа и жировые клетки и в нижнем-клетки СВФ, в том числе и СК. Физические эффекты центрифугирования могут влиять на жизнеспособность и колическтво СК, которые потом используются при культивировании. Так, при скорости центрифугирования 3000 об. в мин. наблюдаются повреждения СК [6]. Перед первым этапом центрифугирования полученного биологического материала в него добавляли бычью сыворотку для подавления действия фермента коллагеназы. Для центрифугирования использовали настольную центрифугу СМ-6М производства Elmi.

   После первой ступени центрифугирования удаляли супернатант, добавляли к осадку раствор Хэнкса с антибактериальными и антимикотическими препаратами, бычью сыворотку, тщательно пипетировали (перемешивали с помощью автоматической пипетки), фильтровали и переходили ко второй ступени центрифугирования. После повторного центрифугирования снова удаляли супернатант, а СК, содержащиеся в осадке, проверяли на жизнеспособность.

   Жизнеспособность клеток определяли по общепринятому методу, при котором мертвые клетки окрашиваются трипановым синим.

Суспензию МСК в количестве 20 мкл смешивали с 20 мкл 0.2% раствора трипанового синего, который заранее приготовили на буферном физиологическом растворе с добавлением 0,02% (от объёма) азида натрия. Для подсчета клеток использовали микроскоп Carl Zeiss Axio. В камере Горяева подсчитывали общее количество клеток и количество живых клеток.

После подсчета жизнеспособных клеток осадок растворяли в ростовой среде. Нами использовалась среда Дульбекко (DMEM-Dulbeccoʼs modified Eagleʼs medium). После растворения осадка в DMEM полученную суспензию разливали в культуральные флаконы Карреля для дальнейшего сохранения популяции клеток и культивирования с целью достижения необходимого количества для клеточной терапии.

 В ходе исследования мы подтвердили простоту экстракции биологического материала (ЖТ) и  организма наряду с другими описанными методами извлечения из различных зон.       В данной работе был использован модернизированный метод выделения СК из ЖТ, основанный на базисном методе. При выделении СК из ЖТ собак разного возраста, массы тела и условий содержаний нами было установлено, что общее количество МСК в каждом образце имело небольшую разницу и составляла в первом случае: 537 тыс.клеток на 1 гр. ЖТ, во втором случае 528 тыс. клеток на 1 гр. ЖТ и в третьем случае 532 тыс. клеток на 1 гр. ЖТ.

   При определении жизнеспособности методом окраски трипановым синим было выяснено, что в первом случае были живы 87% клеток, во втором 89% и в третьем 86%.

    Проведенное исследование показало, что СК из ЖТ собак, выделенные способом, основанным на мануальном методе с применением коллагеназы I-го типа, обладают высокой степенью жизнеспособности, что позволяет проводить их культивирование и в дальнейшем применять в клинической практике. Данные исследования показали, что возраст (допустимый в пределах описанных условий), условия содержания, размер и масса животного-донора ЖТ для выделения жизнеспособных СК не влияют на количество и жизнеспособность МСК.   

Животные-доноры подкожной жировой ткани, должны быть в возрасте от 1.5 до 6 лет,  клинически здоровы и вакцинированы,  не иметь хронических заболеваний, онкологических заболеваний, среднюю и высокую степень ожирения.

 

 

Please reload

Избранные посты

I'm busy working on my blog posts. Watch this space!

Please reload

Недавние посты
Please reload

Архив